新型熒光蛋白可用于活細(xì)胞觀察

日期：2025-05-11 10:44

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摘要：

來(lái)自德國(guó)卡爾斯魯厄理工學(xué)院等處的研究人員發(fā)現(xiàn)了一種新的，來(lái)自珊瑚蟲(chóng)的熒光蛋白，這種熒光蛋白可以用于高分辨率顯微鏡下觀察活細(xì)胞。這一研究成果公布在《自然—方法學(xué)》（Nature Methods）雜志上。領(lǐng)導(dǎo)這一研究的是有名的蛋白質(zhì)相互作用分析專家：Gerd Ulrich Nienhaus，這位科學(xué)家著有《Methods in Molecular Biology: Protein-Ligand Interactions》，詳細(xì)分析了蛋白與配基相互作用研究中的方法分析。熒光蛋白是由很多能產(chǎn)生五彩斑斕的海洋動(dòng)物產(chǎn)生的，包括綠色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，紅色熒光蛋白，橙色熒光蛋白等，這些熒光蛋白有些來(lái)自水母，有些來(lái)自珊瑚，近年來(lái)分子生物學(xué)家門(mén)從中提取出了很多種熒光蛋白及它們的基因，并用基因工程建立了一系列具有不同發(fā)光特性的熒光蛋白。人們?cè)趯?duì)熒光蛋白變體復(fù)雜的光物理學(xué)特性的研究過(guò)程中，找到了可被兩種方式激活的發(fā)色團(tuán)，它們可從靜息態(tài)發(fā)射熒光（即光激活）或者發(fā)生熒光發(fā)射帶寬的轉(zhuǎn)變（即光轉(zhuǎn)化）。這些蛋白出現(xiàn)后被作為一種新型的探針，在活細(xì)胞成像中及對(duì)蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的研究中*為理想。而*新的研究則在珊瑚蟲(chóng)及其親緣物種發(fā)現(xiàn)了新型熒光色素，這為生產(chǎn)生化研究用的先進(jìn)標(biāo)記物提供了無(wú)價(jià)的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)，這項(xiàng)研究*重要的意義是在活體細(xì)胞中的非侵入式動(dòng)態(tài)過(guò)程研究。這種蛋白即EosFP，一種從造礁紅色腦珊瑚中提取出來(lái)的熒光蛋白。基因工程使Iris熒光蛋白具有雙重光激活的特性。**種方式下，Iris蛋白在紫光的照射下，會(huì)發(fā)生不可逆的“光轉(zhuǎn)化”——從發(fā)綠光變成發(fā)紅光。在**種方式下，在用不同波長(zhǎng)的光照射時(shí)，這種蛋白會(huì)或多或少改變它的這兩種發(fā)光方式。這種造礁紅色腦珊瑚：Lobophyllia hemprichii主要位于印度洋至太平洋的珊瑚礁海域，具有一定攻擊性，在夜晚會(huì)伸展出觸須蟄刺臨近的珊瑚，這種珊瑚的顏色包括亮紅色、綠色、橘色、灰色、棕色、褐色。傳統(tǒng)的光活化熒光蛋白PA-FPs（包括PA-GFP等在內(nèi)）的光活化突變體是將野生型中性蛋白質(zhì)改造為陰離子態(tài)得來(lái)的，比如PA-GFP在穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，野生型綠色熒光蛋白在395和475nm處分別有一大一小兩個(gè)吸收峰。當(dāng)用強(qiáng)紫外或紫光照射該蛋白時(shí)，發(fā)色團(tuán)產(chǎn)生光轉(zhuǎn)化，從而改變了大小兩個(gè)吸收峰的相對(duì)消光系數(shù)的比值。結(jié)果是在488nm激發(fā)下，發(fā)射熒光的強(qiáng)度比未刺激前增加了3倍。這種蛋白通常會(huì)融合在目的蛋白上，并且在活細(xì)胞中表達(dá)。使用特定波長(zhǎng)的激光照射細(xì)胞中的一些區(qū)域，蛋白標(biāo)記就會(huì)在另一個(gè)波長(zhǎng)上發(fā)光。這就使在顯微鏡下研究活細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)過(guò)程成為可能。天然狀態(tài)下，四個(gè)IrisFP分子會(huì)形成一個(gè)四聚體，這會(huì)給融合蛋白的應(yīng)用帶來(lái)麻煩，為了避免這個(gè)問(wèn)題，研究者們修飾了這個(gè)蛋白，造成了四個(gè)突變。這就是的單獨(dú)的IrisFP更加穩(wěn)定，減少了它們形成四聚體的可能。研究人員認(rèn)為這種單體的mIrisFP保留了它雙重光激活的特性，而且非常合適作為遺傳編碼的熒光蛋白標(biāo)記。熒光顯微在細(xì)胞學(xué)科學(xué)研究中作為一種非破壞性，靈敏技術(shù)使亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)可視化和監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白移動(dòng)而已被廣泛地應(yīng)用，今天的活細(xì)胞成像已經(jīng)從單純的結(jié)構(gòu)或細(xì)胞器分析，轉(zhuǎn)向?qū)δ艿南嗷ビ绊懹^察與研究，科學(xué)家想在*真實(shí)的動(dòng)態(tài)、三維、多標(biāo)記條件下觀察自然，需要更先進(jìn)的成像條件。在這篇文章中，研究人員還將mIrisFP與多種其他蛋白在細(xì)胞中融合表達(dá)，證明了mIrisFP的應(yīng)用普遍性，研究人員還將脈沖追蹤與熒光激活定位顯微鏡成像技術(shù)相結(jié)合，在高空間分辨率下跟蹤了熒光標(biāo)記融合蛋白的運(yùn)動(dòng)。為定位特異性生物分子在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)用熒光顯微鏡要求生物分子用適當(dāng)熒光團(tuán)標(biāo)記。經(jīng)典地通過(guò)有機(jī)熒光染料(如熒光素)結(jié)合至識(shí)別目標(biāo)結(jié)構(gòu)的一個(gè)配基或一個(gè)抗體標(biāo)記分子。但是，如配基表位（epitope）或基于-抗體熒光標(biāo)記不暴露至細(xì)胞外介質(zhì)，細(xì)胞必須被固定和去垢劑-透性前應(yīng)用熒光檢測(cè)試劑。近年來(lái)FPs已被開(kāi)發(fā)成為熒光顯微鏡的強(qiáng)有力工具。**個(gè)被發(fā)現(xiàn)的FP是來(lái)自水母（Aequorea）victoria（avGFP）綠色FP，它轉(zhuǎn)換生成的生物發(fā)光能量被近端螢光素酶通過(guò)共振能量變換為綠色熒光。而在活細(xì)胞中跨越至紅色熒光研究來(lái)自在非-生物發(fā)光珊瑚蟲(chóng)綱（anthozoa）avGFP同源物的發(fā)現(xiàn)。珊瑚蟲(chóng)綱FPs和avGFP間有相對(duì)小相似性，氨基酸序列水平有20%左右相同。這種珊瑚蟲(chóng)綱FPs的熒光延伸至可見(jiàn)光譜的紅**和使活-細(xì)胞多重復(fù)用的進(jìn)一步水平。比如近期澳大利亞的研究人員也在澳大利亞發(fā)現(xiàn)大量熒光珊瑚。這些珊瑚有助于研究人員研究癌細(xì)胞并更好地了解全球氣候變化。他們?cè)谖挥诎闹薮箨懸詵|大約600公里處的豪勛爵島附近海域，發(fā)現(xiàn)“數(shù)以百計(jì)深綠色、藍(lán)色和散發(fā)著紅色熒光”的珊瑚。研究人員將令珊瑚泛光的基因“植入”健康細(xì)胞和癌細(xì)胞的分子中，隨后通過(guò)一種特制的感光顯微鏡觀察兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)和變化過(guò)程。薩利赫說(shuō)，研究人員將利用這些熒光基因“點(diǎn)亮”活體細(xì)胞，觀察它們的機(jī)理，研究癌細(xì)胞與健康細(xì)胞的不同之處。薩利赫認(rèn)為，這些熒光分子正在改變細(xì)胞科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的研究方式。

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